Participation of the endoplasmic reticulum protein chaperone thio-oxidoreductase in gonadotropin-releasing hormone receptor expression at the plasma membrane

Chaperone members of the protein disulfide isomerase family can catalyze the thiol-disulfide exchange reaction with pairs of cysteines. There are 14 protein disulfide isomerase family members, but the ability to catalyze a thiol disulfide exchange reaction has not been demonstrated for all of them. Human endoplasmic reticulum protein chaperone thio-oxidoreductase (ERp18) shows partial oxidative activity as a protein disulfide isomerase. The aim of the present study was to evaluate the participation of ERp18 in gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRHR) expression at the plasma membrane. Cos-7 cells were cultured, plated, and transfected with 25 ng (unless indicated) wild-type human GnRHR (hGnRHR) or mutant GnRHR (Cys14Ala and Cys200Ala) and pcDNA3.1 without insert (empty vector) or ERp18 cDNA (75 ng/well), pre-loaded for 18 h with 1 µCi myo-[2-3H(N)]-inositol in 0.25 mL DMEM and treated for 2 h with buserelin. We observed a decrease in maximal inositol phosphate (IP) production in response to buserelin in the cells co-transfected with hGnRHR, and a decrease from 20 to 75 ng of ERp18 compared with cells co-transfected with hGnRHR and empty vector. The decrease in maximal IP was proportional to the amount of ERp18 DNA over the range examined. Mutants (Cys14Ala and Cys200Ala) that could not form the Cys14-Cys200 bridge essential for plasma membrane routing of the hGnRHR did not modify maximal IP production when they were co-transfected with ERp18. These results suggest that ERp18 has a reduction role on disulfide bonds in wild-type hGnRHR folding.

Contribuiçäo ao conhecimento das lesöes de estocagem: estudo do sistema de óxido-reduçäo glutationa dependente em eritrócitos coletados em CPDA-1 / Contribution on knowledge of storage lesions: glutathione anti-oxidant system study

A presente investigaçäo teve como objetivo o estudo do sistema de óxido-reduçäo glutationa-dependente em 34 CGV coletados em CPDA-1, nos dias 0 e 35 de estocagem. Amostras de 12 CGV foram examinadas logo após a coleta em heparina e CPDA-1, constituindo o grupo dia 0. Os valores do dia 0 foram considerados controles para 12 CGV examinados no 35§ dia de estocagem. Foram efetuados testes de reduçäo da MetaHb pelo Am (atividade G6PD) e pela CIS (atividade GSSG-Rd), dosagens de GSHt, GSSG, MDA total e eritrocitário, MetHb e Hb plasmática. Os resultados do dia 0 demonstraram preservaçäo da capacidade antioxidante da via das pentoses. Foi também observada uma lesäo incipiente da membrana, principalmente após centrifugaçäo refrigerada em GV heparinizados. No dia 35, constatou-se atividade deficiente da G6PD, deficiência de GSSG-Rd (funcional, dependente da atividade G6PD), diminuiçäo da GSHt, da GSSG, manutençäo da relaçäo [GHS] / [GSSG], refletindo uma lentidäo na capacidade antioxidante da vida das pentoses. Pelos altos níveis de Hb plasmática, ficou evidenciada uma importante lesäo da membrana, associada entretanto, a níveis pouco elevados de MDA. Estes CGC que sofreram manipulaçäo eventual e freqüênte, durante a estocagem, foram comparados a 4 unidades de CGV estocados imóveis pelo mesmo período, para GSHt e atividades G6PD e GSSG-Rd. As unidades agitadadas apresentaram o dobro das taxas de GSHt, sugerindo que a agitaçäo favorece maior síntetse e também maior reciclagem da GSH. A atividade G6PD foi menor, embora näo significante, nas unidades agitadas, provavelmente pela oxidaçäo dos seus grupamentos SH, pois um maior fluxo de oxigênio ocorre no interior da bolsa. A GSSG-Rd acompanhou funcionalmente a deficiência em G6PD. Foram estudados 10 CGV estocados imóveis por 35 dias, 6 de 150 ml e 4 de 300 ml, comparando-se amostras de GV do topo, centro, fundo da bolsa e após mistura completa do conteúdo, para alguns índices hematimétricos, GSHt e atividades G6PD e GSSG-Rd. A camada do fundo dos CGV demonstrou ser a mais compacta e menos preservada, com GV de menor VCM, maior CHCM e menores níveis de GSHt. A camada do centro foi a melhor preservada, tanto quanto a índices hematimétricos, quanto a taxas de regeneraçäo de GSHt e níveis mais homogêneos de G6PD. Nestas unidades imóveis, parece ocorrer um "choque metabólico", quando da mistura dos GV com plasma, proteases, oxigênio e espécies oxigênio reativas, pois a regeneraçäo da GSHt é semelhante...